RMCE Kassettenaustauschverfahren
RMCE, recombinase-mediated cassette exchange
Gezielter Austausch von Genkassetten
als Verfahren der reversen Genetik und zur systematischen Modifikation höherer Zellen Die Produktion pharmazeutisch bedeutender Proteine wird häufig über die genetische Modifikation von Säugerzellen erreicht. Dies bedingt Techniken des Gentransfers und die effiziente Übersetzung der genetischen Information (Expression) in der Zielzelle. Auf analogen Prinzipien beruhen moderne Ansätze zur Gentherapie.Herkömmliche Verfahren der Modifikation tierischer Zellen sind wenig zuverlässig, nicht zuletzt deshalb, weil epigenetische Grundprinzipien noch zu wenig bekannt sind: eingeschleuste Gene integrieren nur sporadisch in das Erbmaterial der Wirtszelle, und wenn sie es tun, dann oft an unpassenden Stellen. Infolgedessen wird das Fremdgen nicht oder nur unregelmäßig abgelesen oder bleibt inaktiv. Zu allem Überfluss lösen sich die neu eingebauten Gene oft wieder aus dem Wirtsgenom heraus, die Zellen werden instabil.
Hier setzt das RMCE-Kassettenaustauschverfahren an, das Vektoren mit Werkzeugen der Hefe versieht:
RMCE-Prinzip: Austausch genetischer Kassetten (´flip´), ermöglicht durch die RMCE Rekombinase (´Flp´) der Hefe. Der Einschub zeigt FRT-Stellen (Fn), die, zu Sätzen zusammengestellt, das Verfahren ermöglichen. Im unteren Teil des Einschubs werden Expressionscharakteristiken nach konventionellem Transfer (links) und aufgrund von RMCE (rechts) dargestellt
In den meisten Hefestämmen gibt es ein ´2-micron circle´ genanntes Gebilde, dessen Überleben durch eine Rekombinase mit ungewöhnlichen Eigenschaften garantiert wird. Dieses Enzym bewirkt den ´crossover´ zweier identischer, kurzer Erkennungsstellen (Flp-recombinase targets, FRT; Halbpfeile in der Abbildung). Das Spektrum der Rekombinationsmöglichkeiten zwischen zwei solchen Stellen ist begrenzt und umfasst (je nach der relativen Orientierung) Inversion, Deletion oder eine ineffiziente Addition.
1994 wurden Mutanten (Fn) dieser FRT-Stellen (F) hergestellt, die untereinander ein effizientes ´crossover´ nach dem Vorbild des Wildtyps ermöglichen (s. Referenz). Eines zeigen sie nicht: eine Kreuzrekombination mit F, die zur Deletion führen würde. Damit befinden wir uns in der Situation der Abbildung:
- ein beliebiges Gen (hier ein komplexer Selektionsmarker) wird durch einen Satz aus FRT-Stellen, Fn und F umgeben; nach seiner Einführung in das Genom der Wirtszelle werden die Eigenschaften verschiedener Integrationsstellen charakterisiert und besonders geeignete Klone isoliert;
- das eigentlich interessierende Gen wird zwischen einen entsprechenden Satz an Fn und F Stellen (unterschiedlich markierte Halbpfeile) kloniert und als Teil eines zirkulären Vektors in die Wirtszelle transferiert. Flp Rekombinase wird nun genutzt, um einen doppelt-reziproken ´crossover´ zu induzieren. Dies Verfahren dirigiert nach dem "RMCE- Kassettenaustauschrinzip" das interessierende Gen exakt an den vorbestimmten Ort - ein Prozess, der sich beliebig oft mit unterschiedlichen Konstrukten wiederholen lässt.
Dieses Verfahren wird nicht nur für die gezielte Konstruktion biotechnologisch bedeutender Zellinien eingesetzt, sondern erlangt auch zunehmende Bedeutung für die systematische Modifikation von Stammzellen, z.B. mit der Absicht, gezielt transgene Tiere zu schaffen.
