DNA-Sequenzierung
DNA-Sequenzierung ist die Bestimmung der DNA-Sequenz, also der Nukleotid-Abfolge, von genomischer DNA. Auf diese Weise konnte seit 1995 das Genom von über 150 verschiedenen Organismen entschlüsselt werden (s. Sequenzierte Organismen).Die Sequenzierung kann mit verschiedenen Methoden durchgeführt werden, wobei es drei praktisch verwendbare Methoden zur Bestimmung der eigentlichen Nukleotidabfolge gibt. An die Sequenzierung schließt sich in der Regel die DNA-Sequenzanalyse an.
Sequenzierung im großen Maßstab, wie für das Humangenom-Projekt stellte die bisher größte Herausforderung für die Bioinformatik dar.
| Table of contents |
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1.1 Maxam und Gilbert Methode
2 Hilfsmethoden1.2 Didesoxymethode nach Sanger 1.3 Sequenzierung durch Hybridisierung 3 Weblinks |
Sequenzierungsmethoden
Maxam und Gilbert Methode
Die Methode der chemischen Spaltung nach Maxam und Gilbert (1977) diente ihren Erfindern zur erfolgreichen Bestimmung der Operon-Sequenz eines Bakteriengenoms. Sie wurde vedrängt von der zwar zeitgleich unabhängig entstandenen, aber schnelleren und leichter automatisierbaren
Didesoxymethode nach Sanger
Die Didesoxymethode wird auch "kontrollierte Unterbrechung der enzymatischen Replikation" genannt und von Sanger um 1975 entwickelt und ebenfalls 1977 mit der ersten vollständige Sequenzierung eines Genoms (Bakteriophage φX174 [1]) vorgestellt.
Man verwendet dazu heutzutage die Polymerase-Kettenreaktion (PCR). In vier sonst gleiche Ansätze wird je eine unterschiedliche Base als Didesoxynukleotid (ddNTP) zugegeben. Ohne die Hydroxyfunktion ist eine DNA-Verlängerung durch DNA-Polymerase nicht möglich und es kommt zum Kettenabbruch. Da die ddNTPs zufällig eingebaut werden, bricht die DNA-Synthese an verschiedenen Stellen ab. Nach der PCR wird jeder Ansatz getrennt mittels Gelelektrophorese getrennt und man kann die Sequenz an Hand des Gels ablesen.
Sequenzierung durch Hybridisierung
Zu diesem Zweck werden auf einem Glasträger (DNA-Chip oder Microarray) kurze DNA-Abschnitte (Oligonukleotide) in Matrix-Anordnung fixiert. Die Fragmente der zu sequenzierenden DNA werden mit Farbstoffen markiert und das Fragmentgemisch wird auf der Oligonukleotidmatrix ausgebracht, so dass komplementäre fixierte und freie DNA-Abschnitte miteinander hybridisieren können. Nach dem Auswaschen ungebundener Fragmente lässt sich das Hybridisierungsmuster anhand der Farbmarkierungen und deren Intensität ablesen. Da die Sequenzen der fixierten Oligonukleotide und deren Überlappungsbereiche bekannt sind, kann man letztlich aus dem Farbmuster auf die zugrundeliegende Gesamtsequenz der unbekannten DNA rückschließen.
Hilfsmethoden
Weblinks
